Spettrometria di massa

Il concetto alla base della spettrometria di massa è relativamente semplice: un composto viene ionizzato (Metodo di ionizzazione), gli ioni vengono separati  in base al proprio rapporto massa/carica (analizzatore) e gli ioni prodotti raggiungono il rilevatore dove l’energia ricevuta è convertita in un segnale elettrico opportunamente amplificato per produrre lo spettro di massa corrispondente (detector). In pratica uno spettrometro di massa è in grado di determinare la massa molecolare delle molecole presenti in una miscela. In commercio ci sono diversi spettrometri di massa che si differenziano in base alla sorgente di ioni e al tipo di analizzatore.

Spettrometria di massa-Metodo di ionizzazione

Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)

In questo tipo di ionizzazione il campione viene miscelato insieme ad una matrice, una sostanza con una grande capacità di assorbire la radiazione UV e in grado di formare cristalli. Un impulso di raggio laser è  utilizzato per colpire il cristallo e causare la ionizzazione delle molecole della matrice che poi a sua volta trasmetteranno la ionizzazione al campione. Le molecole si caricheranno positivamente (nel caso di proteine) e passeranno allo stato gassoso. Questo processo è chimato desorbimento. Questo tipo di ionizzazione è detta blanda perchè generalmente causa la formazione di ioni monocarica.

Esistono diverse tipi di matrici, utilizzate a seconda del tipo di molecola che si vuole studiare:

Campione

Matrice

Peptidi < 10 kDa

α-cyano-4- hydroxycinnamic acid (CHCA)

Protein > 10 kDa

Sinapinic acid (SA)

Super DHB

Oligonucleotides

2,5- dihydroxybenzoic acid (DHB)

3-Hydroxypicoline acid

2,4,6 trihydroxyacetophenone monohydrate (THAP)

Polymer

α-cyano-4- hydroxycinnamic acid (CHCA)

2,5- dihydroxybenzoic acid (DHB)

Glycosylated protein

Super DHB

Neutral carbohydrate

2,5- dihydroxybenzoic acid (DHB)

I principali vantaggi della spettrometria di massa MALDI sono la semplicità e la facilità con cui viene preparato il campione, inoltre permette l’analisi di proteine con un peso molecolare relativamente alto. La tecnica MALDI è invece limitata dall’interferenza prodotta dai segnali della matrice nell’intervallo di massa tra 50-500 m/z. Il campione spesso non si trova uniformemente distribuito nel cristallo, per questo motivo questi spettrometri non sono adatti per l’analisi quantitativa.

Surface-enhanced laser desorption/ionization (SELDI)

SELDIE’ una variante della spettrometria di massa MALDI, il campione viene deposto su dei chip con una superficie cromatografica in grado di legare solo alcuni tipi di molecole. In questo modo è possibile rilevare peptidi e proteine poco abbondanti che normalmente verrebbero oscurate da proteine più concentrate. Le principali cromatografie disponibili sono:

- Scambio anionico (forte e debole)

- Scambio cationico (forte e debole)

- Affinità per metalli (Ni,Cu,Zn,Cu, Ga)

- Cromatografie idrofobiche ( mimano cromatografie C6 , C12 e C18)

Su particolari chip è anche possibile legare anticorpi o frammenti di DNA per catturare specifiche molecole.

Questa spettrometria si volge in quattro fasi:

- Fase preliminare: Estrazione della componente proteica dai campioni da analizzare

- Attivazione/binding: Attivazione della superficie cromatografica con uno specifico Buffer e aggiunta della miscela proteica precedentemente estratta.

- Fase lavaggio: lavaggio delle molecole non legate o legate in modo aspecifico. Questa fase permette la rimozione di Sali, detergenti e altre molecole utilizzate nell’estrazione proteica iniziale.

- Ionizzazione: Aggiunta della matrice, le stesse utilizzate nella ionizzazione MALDI e ionizzazione con laser ad azoto

Questa tecnologia è molto utilizzata su campioni biologici (estratti cellulari, plasma, siero, urine e campioni alimentari) per studi di proteomica e di biomarker discovery

ESI – Electrospray Ionization

spettrometria di massaQuesto tipo di ionizzazione permette ad un analita (es proteine) disciolto in un solvente di essere ionizzato. Generalmente gli spettrometri con questo tipo di ionizzazione sono accoppiati ad una HPLC capillare o nano. Le frazioni in uscita dall’HPLC passano attraverso un capillare a pressione atmosferica mantenuto ad alto voltaggio (3-4 kV). Questo alto voltaggio disperde il flusso del liquido e lo trasforma in tante piccole goccioline altamente caricate, generalmente dal diametro di alcuni μm (1-60 μm). L’evaporazione del solvente causa una ulteriore riduzione del diametro delle gocce e quindi un aumento della densità carica. L’aumento delle cariche sulla superficie della goccia induce una forza repulsiva che culmina con una esplosione Coulombiana, che riduce ulteriormente il diametro delle goccie. Questo processo continua fino a che le gocce non sono abbastanza piccole da permettere allo ione dell’analita il passaggio alla fase gassosa. Per facilitare la formazione delle gocce in uscita dal capillare può essere aggiunto un flusso nebulizzato di azoto. In aggiunta, in alcuni casi, per facilitare il processo di evaporazione del solvente, all’ingresso del capillare è applicato un flusso di azoto anidro.

esi1

Un parametro importante da tenere in considerazione per la ionizzazione ESI è la concentrazione del Buffer in cui è disciolto l’analita. La concentrazione del buffer influisce sulla efficienza di ionizzazione, generalmente per concentrazioni maggiori a 1 mM la relazione tra concentrazione dell’analita e risposta non è più lineare.

Un altro parametro importante è il flusso con cui viene pompato l’analita e il suo solvente nel capillare ad alto voltaggio. Per ESI tradizionali generalmente il flusso varia dai 5-10 μL/min, che comporta l’utilizzo di colonne capillari HPLC dal diametro  interno di 0.5-0.65 mm. Negli ultimi anni sono state introdotte delle nano-HPLC che permettono di scendere a flussi nell’ordine 20-150 nL/min, con colonne dal diametro interno di  0.075 mm. Questo flussi permettono di ottenere gocce con un diametro dalle 100 alle 1000 volte più piccole rispetto ad un convenzionale HPLC-ESI. Questo permette di raggiungere una efficienza di ionizzazione del 100 %.

A differenza della ionizzazione MALDI, questo tipo di ionizzazione produce un grande numero di cariche. Per capire il numero di cariche di un dato picco è necessario applicare la seguente formula:

n1 = (m2-1) / (m1-m2)

dove

n1 = numero di cariche del picco di cui si desidera sapere il  numero di cariche

m1 = rapporto m/z del picco di cui si desidera sapere il  numero di cariche

m2 = rapporto m/z del picco precedente di cui si desidera sapere il  numero di cariche

Ad esempio se una data proteina presenta 9 cariche, il rapporto m/z elaborato dallo strumento sarà la media dei valori di m/z di ciascun ione della proteina.

Spettrometria di massa – Analizzatori

Time of flight (TOF)

Gli spettrometri di massa possiedono diversi metodi per determinare il rapporto massa/carica dello ione, uno metodo molto comune è il tempo di volo (Time of flight). Gli ioni provenienti dalla sorgente ionica sono accelerati da un potenziale (V) alla stessa energia cinetica, quindi sono lasciati andare alla deriva lungo un tubo verso un rilevatore. Se si assume che tutti gli ioni che arrivano all’ingresso del tubo di volo possiedono la stessa energia, data da:

z e V = mv2 / 2 = Ec

dove:

V = potenziale applicato

z = il numero di cariche

e = la carica dell’elettrone

m = la massa dello ione

v = la velocità dello ione

allora ioni aventi masse diverse possiederanno differenti velocità:

v = (2 z e V  /m) ½

Se uno spettrometro possiede un tubo di volo di lunghezza L, il tempo di volo per un dato ione è dato da:

t = (L2 m / 2 z e V)

Partendo dal rapporto m/z funzione del tempo di permanenza nel tubo di volo,  può essere calcolata la massa di un dato ione. Il vantaggio di questo analizzatore  è la possibilità di analizzare anche macromolecole di elevato peso molecolare (fino a 60000 – 80000 Da). Generalmente questo tipo di analizzatore è accoppiato ad una sorgente di ioni MALDI.  Il tubo di volo ha però una bassa risoluzione (bassa capacità di discriminare du ioni con m/z simili) per ovviare a questo la maggiorparte di questi analizzatori sono dotati di un “Reflectron”  cioè uno specchio i grado di riflettere gli ioni e quindi di fare percorrere il doppio della strada allo ione. In questo modo è possibile distinguere 2 ioni aventi tempo di percorrenza nel tubo di volo molto simili. L’uso del “Reflectron”  limita il range di di massa molecolare analizzabile che è compreso trà 200 e  5000-10000 Da.

reflectron2

Riccardo Beretta

About Riccardo Beretta

Laureato presso l’università di Milano Bicocca in biotecnologie industriali nell’ottobre del 2007. Fino al 2013 ricercatore in azienda biotech nel campo della proteomica differenziale con spettrometria di massa, nei settori alimentare, veterinario e farmaceutico. Attualmentre responsabile della R&D in un'azienda biotech altamente innvovativa, nel settore della produzione di biogas e recupero-nutrienti. Scarica il Curriculum