Elettroforesi

Elettroforesi Monomensionale

L’elettroforesi è un metodo di separazione relativamente veloce per separare frammenti di DNA e proteine. Questo sistema consiste nel fare polimerizzare un gel,  generalmente poliacrilammide per le proteine e agarosio per grossi frammenti di DNA. Questi gel possono avere diversa grandezza e generalmente hanno uno spessore di pochi millimetri. Maggiore sarà la concentrazione dell’acrilammide o dell’agarosio, più il gel avrà delle maglie strette e quindi più fatica faranno le proteine o frammenti di DNA a passare nel gel. Come regola generale, gel a più elevate concentrazioni saranno più adatti a separare molecole più piccole, viceversa gel con maglie più grandi separeranno meglio molecole di elevata grandezza.

Il gel è inserito in una vaschetta ripiena di una soluzione salina dove viene applicato un campo elettrico. I gel fungono come setacci molecolari, le proteine o i frammenti di DNA sono separate in base alla loro dimensione, la loro velocità di migrazione dipende anche dal potenziale elettrico applicato.

Elettroforesi monodimensionale

Nei gel di proteine i campioni vengono caricati in appositi pozzetti, prima di essere separte le proteine passano per uno strato di gel chiamato “Stacking Gel”. In questo strato il gel è poco concentrato,  in questo modo le proteine non vengono separate ma vengono allineate prima di entrare nel gel di corsa. Inoltre il campione prima di essere caricato nel gel, viene miscelato con un detergente anionico (caricato negativamente) chiamato SDS. Questa molecola ha lo scopo di legare le proteine e caricarle negativamente. In questo modo tutte le proteine, quando verrà applicato un campo elettrico, migreranno verso il polo positivo.

sds-proteine

Finita la corsa elettroforetica le proteine sono colorate con un colorante chiamato Blu di Coomassie, che lega le proteine ma non il Gel,  nel caso di frammenti di DNA si usa l’etidio bromuro. Sarà quindi possibile osservare diverse bande, ognuna di queste banda corrisponderà ad una o più proteine o frammenti di DNA aventi stesso peso molecolare. Le proteine più piccole verranno visualizzate in fondo al gel, perché saranno migrate più facilmente tra i pori dei gel. Caricando su gel anche molecole a peso molecolare noto è possibile stabilire approssimativamente il peso molecolare della nostra banda.

gel

Elettroforesi Bidimensionale

Un’altra tecnica molto usata in proteomica è chiamata elettroforesi  bidimensionale. In questo caso le proteine vengono separate in base alla loro grandezza (peso molecolare), come nella elettroforesi monodimensionale, ma anche in base al loro punto isoelettrico, cioè il valore di pH per cui tutte le cariche positive e negative si annullano (proteina non possiede più una carica netta). In questo modo non avremo più delle bande ma una serie di puntini (ognuno corrispondente ad una sola proteina) ed una risoluzione di gran lunga migliore rispetto alla elettroforesi monodimensionale. Le diverse proteine così separate possono anche essere estratte dal gel, digerite con tripsina e analizzate con spettrometro di massa per l’identificazione.

Elettroforesi BidimensionaleQuesta tecnica è particolarmente adatta per proteine ad alto peso molecolare ma  è poco sensibile per piccole proteine e peptidi.

Riccardo Beretta

About Riccardo Beretta

Laureato presso l’università di Milano Bicocca in biotecnologie industriali nell’ottobre del 2007. Fino al 2013 ricercatore in azienda biotech nel campo della proteomica differenziale con spettrometria di massa, nei settori alimentare, veterinario e farmaceutico. Attualmentre responsabile della R&D in un'azienda biotech altamente innvovativa, nel settore della produzione di biogas e recupero-nutrienti. Scarica il Curriculum