Cromatografia HPLC

In generale per cromatografia si intende un insieme di tecniche e metodi che permettono di separare una miscela complessa di molecole. HPLC è una tecnica cromatografica basata su un fase mobile  fatta flussare grazie a delle pompe  e una fase stazionaria solida impaccata in una colonna cromatografica. La differenza rispetto ad altre cromatografie liquide, è l’utilizzo di elevate pressioni, che permettono di separare miscele molto complesse in poco tempo. Il campione che si vuole separare è miscelato alla fase mobile e quindi trasportato in colonna a contatto con la fase stazionaria. La molecola a seconda della sua struttura chimica avrà una diversa “affinità” per la fase mobile e per la fase stazionaria. Maggiore è l’affinità per la fase stazionaria, maggiore è il tempo che la molecola ci metterà ad uscire dalla colonna. Il tempo impiegato dalla molecola ad uscire dalla colonna è chiamato tempo di ritenzione.

HPLC

Il cuore di un sistema HPLC sono le colonne e la fase stazionaria impaccata al loro interno. Normalmente le colonne hanno una lunghezza variabile tra i 10 e i 30 cm, anche se ultimamente vengono prodotte colonne sempre più corte intorno ai 3 cm. Nelle biotecnologie spesso l’HPLC viene utilizzata per separare una miscela proteica complessa,  in questo caso la fase stazionaria avrà diverse proprietà chimiche a seconda della tipologia di separazione che si vuole effettuare.

Cromatografia a fase inversa (reverse phase)

In questa cromatografia abbiamo una fase stazionaria apolare (di natura idrofobica non solubile in acqua) e una fase mobile polare (di solito una miscela di acqua e acetonitrile). Questa cromatografia permette di separare le proteine/molecole in base alla polarità, in aggiunta a seconda della lunghezza delle catene idrofobiche della fase stazionaria è possibile separare proteine di diversa grandezza. Le colonne C4 possiedono una corta catena composta da 4 atomi di carbonio e sono più adatte alla separazione di grosse molecole, invece le colonne C18 con una catena idrofobia di 18 atomi di carbonio sono più adatta alla separazione di piccole proteine o peptidi.

Cromatografia a scambio ionico

In questa cromatografia abbiamo una fase stazionaria caricata positivamente o negativamente, in questo modo la fase stazionaria avrà affinità per molecole con carica netta opposta (positiva o negativa).  Questo tipo di cromatografia sarà molto influenzato dal pH della fase mobile, dato che la carica netta delle molecole da separare è influenzata dal pH del solvente in cui la molecola disciolta. pH acidi permetteranno di ionizzare positivamente le molecole, invece pH basici caricheranno negativamente le molecole da separare. L’eluizioni delle molecole di solito avviene aumentando la forza ionica, generalmente incrementando la concentrazione di NaCl nella fase mobile. Gli ioni Na+ o Cl- con l’aumento della concentrazione spiazzeranno le molecole legate alla fase stazionaria, permettendo quindi l’eluizione delle molecole, che si staccheranno gradualmente a secondo della loro affinita per la fase stazionaria. Un altro sistema di eluizione consiste nella variazione del pH della fase mobile. Ad esempio in una cromatografia a scambio cationico, il passaggio da pH acidi a pH basici cosente gradualmente di polarizzare le molecole negativamente, in modo che perdano affinità per la fase stazionaria. Nella separazione di molecole proteiche è possibile prevedere la carica della proteina grazie alla conoscenza del punto isoelettrico. In generale un pH della fase mobile al di sotto del punto isolettrico della proteina produrrà una carica netta positiva, al contrario un pH più alto del punto isoelettrico produrra una carica netta negativa.

cromatografia a scambio ionico

Cromatografia ad esclusione

In questa cromatografia si separano molecole in base alla loro grandezza e non in base alla affinità con la fase stazionaria. Infatti i materiali utilizzati per la fase stazionaria sono inerti (non interagiscono) verso i campioni biologici. In pratica, le molecole piccole riusciranno a passare attraverso gli stretti cunicoli tra le diverse particelle che costituiscono la resina, invece le molecole più grandi non riusciranno a passare da questi spazi e quindi verrano escluse e usciranno più velocemente, perché non dovranno passare all’interno della resina.

Cromatografia ad esclusione

Cromatografia di affinità

Questa cromatografia è molto utilizzato nell’ambito delle biotecnologie, alla fase stazionaria vengono legati degli anticorpi in grado di catturare solo specifiche molecole. In questo modo è possibile isolare e purificare una singola proteina all’interno di una miscela complessa di altre proteine.

Cromatografia ad affinità

Rivelatori HPLC

In una HPLC in uscita dalla colonna cromatografia è presente un rilevatore che permette di “rilevare” le molecole e quindi di valutare se la miscela iniettata è stata adeguatamente separata. I più comuni metodi di rilevazione sono  UV/VISIBILE (ultra violetto/visibile) , IR (infrarosso), indice di rifrazione e fluorescenza. L’utilizzo dei  rilevatori dipende dalla natura chimica delle miscele da separare.

Visto il grande successo della sezione strumentale del sito “Biotecnologie per tutti”, abbiamo deciso di aggiungere una galleria fotografica riguardante i differenti compartimenti di una HPLC.

L’utilizzo delle foto in questa sezione è libero, chiediamo soltanto di linkare il sito  Biotecnologie per tutti. Grazie!!

Riccardo Beretta

About Riccardo Beretta

Laureato presso l’università di Milano Bicocca in biotecnologie industriali nell’ottobre del 2007. Fino al 2013 ricercatore in azienda biotech nel campo della proteomica differenziale con spettrometria di massa, nei settori alimentare, veterinario e farmaceutico. Attualmentre responsabile della R&D in un'azienda biotech altamente innvovativa, nel settore della produzione di biogas e recupero-nutrienti. Scarica il Curriculum