In generale per cromatografia si intende un insieme di tecniche e metodi che permettono di separare una miscela complessa di molecole. HPLC è una tecnica cromatografica basata su un fase stazionaria solida impaccata in una colonna e una fase mobile fatta flussare grazie a delle pompe attraverso la colonna. La differenza rispetto ad altre cromatografie liquide, è l’utilizzo di elevate pressioni nella colonna che permettono di separare miscele molto complesse in poco tempo. Il campione che si vuole separare è  miscelato alla fase mobile e quindi trasportato in colonna a contatto con la fase stazionaria. La molecola a seconda della sua struttura chimica possiederà una diversa “affinità” per la fase mobile e per la fase stazionaria. Maggiore è l’affinità per la fase stazionaria, maggiore è il tempo che la molecola ci metterà ad uscire dalla colonna. Il tempo impiegato dalla molecola ad uscire dalla colonna è chiamato tempo di ritenzione.

Il cuore di un sistema HPLC sono le colonne e la fase stazionaria impaccata al suo interno. Normalmente queste colonne hanno una lunghezza variabile tra i 10 e i 25 cm, anche se ultimamente vengono prodotte colonne sempre più corte intorno ai 3 cm. Nelle biotecnologie spesso l’HPLC viene utilizzata per separare una miscela proteica complessa,  in questo caso la fase stazionaria possiederà diverse proprietà chimiche a seconda della tipologia di separazione che si vuole effettuare.

Cromatografia a fase inversa: In questa cromatografia abbiamo una fase stazionaria apolare (di natura idrofobica non solubile in acqua) e una fase mobile polare (di solito una miscela di Acqua e metanolo). Questa cromatografia permette di separare le proteine in base alla polarità ed inoltre a seconda della lunghezza delle catene idrofobiche della fase stazionaria è possibile separare proteine di diversa grandezza. Le colonne C4 possiedono una corta catena composta da 4 atomi di carbonio e sono più adatte alla separazione di grosse proteine, invece le colonne C18 con una catena idrofobia di 18 atomi di carbonio è più adatta alla separazione di piccole proteine o peptidi.

Cromatografia a scambio ionico: in questa cromatografia abbiamo una fase stazionaria caricata positivamente o negativamente, in questo modo la fase stazionaria avrà affinità per molecole con carica netta opposta (positiva o negativa). Chiaramente questo tipo di cromatografia sarà molto influenzato dal pH della fase mobile, perché la carica netta delle molecole da separare è influenzato dal pH del solvente in cui è disciolta. pH acidi permetteranno di ionizzare positivamente le molecole, invece pH basici caricheranno negativamente le molecole da separare.

Cromatografia ad esclusione: In questa cromatografia si separano molecole in base alla loro grandezza e non in base alla affinità con la fase stazionaria. Infatti i materiali utilizzati per la fase stazionaria sono inerti (non interagiscono) verso i campioni biologici. In pratica, le molecole piccole riusciranno a passare attraverso gli stretti cunicoli tra le diverse particelle che costituiscono la resina, invece le molecole più grandi non riusciranno a passare da questi spazi e quindi verrano escluse e usciranno più velocemente perché non dovranno passare all’interno della resina.

Cromatografia di affinità: Questa cromatografia è molto utilizzato nell’ambito delle biotecnologie, alla fase stazionaria vengono legati degli anticorpi in grado di catturare solo specifiche molecole. In questo modo è possibile isolare e purificare una singola proteina all’interno di una miscela complessa di altre proteine.

In una HPLC in uscita dalla colonna cromatografia è presente un rilevatore che permette di “rilevare” le molecole in uscita, e quindi di valutare se la miscela che è stata iniettata è stata adeguatamente separata.